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近年來，細(xì)胞外囊泡（EV）研究正加速發(fā)展。2011年約有200篇相關(guān)論文發(fā)表，但2016年一年就有1000篇以上的相關(guān)論文發(fā)表，論文內(nèi)容涉及各種生理功能

和病理癥狀。EV大致可分為核內(nèi)體來源的外泌體和細(xì)胞膜來源的微囊泡，但即便是用現(xiàn)在提取精度最高的差速離心法也難以將二者明確分離，所以簡單地將

10,000×g離心后未沉淀的EV稱為Small EV（主要是外泌體）1）。外泌體是由各種細(xì)胞分泌的小型膜囊泡（直徑30~100 nm），存在于大多數(shù)體液（如血液、

尿液、髓液等）和細(xì)胞培養(yǎng)液中。外泌體是由脂質(zhì)雙分子層包被的膜囊泡，產(chǎn)生于稱為多囊泡胞內(nèi)體的胞內(nèi)囊泡中，多囊泡胞內(nèi)體通過與細(xì)胞膜融合將外泌體

釋放到細(xì)胞外。外泌體含核內(nèi)體來源的蛋白質(zhì)（例如ESCRTs等）和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸相關(guān)蛋白（例如Rab GTPase等）、以及細(xì)胞膜來源蛋白（例如CD63、CD81等）

等為代表的各種分泌細(xì)胞來源的蛋白和RNA，同時還含分泌細(xì)胞的細(xì)胞膜來源和內(nèi)體膜來源的脂質(zhì)（如膽固醇和鞘磷脂等）2）。多年來研究人員認(rèn)為外泌體的

作用是參與細(xì)胞內(nèi)廢棄物的排放。但是近年來外泌體在生物體內(nèi)作為運(yùn)載脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、RNA等細(xì)胞間信息傳遞的新型媒介倍受矚目。除了闡明外泌體生理或

病理功能外，面向于臨床應(yīng)用的功能研究也迅速發(fā)展，尤其是診斷、治療和生物標(biāo)記物開發(fā)等。

現(xiàn)在，外泌體研究橫跨幾乎所有的研究領(lǐng)域（免疫、神經(jīng)系統(tǒng)、腫瘤、內(nèi)分泌、循環(huán)系統(tǒng)等）。例如，免疫細(xì)胞來源的外泌體含有抗原肽/MHC復(fù)合體和各種抗

原，可能控制著免疫細(xì)胞間抗原信息的交換、免疫細(xì)胞活化、非活化等各種免疫應(yīng)答機(jī)制3）。外泌體在神經(jīng)系統(tǒng)中與神經(jīng)回路的控制相關(guān)4），同時各種神經(jīng)退

行性疾病的致病蛋白還可以通過外泌體釋放到細(xì)胞外并傳遞到其他細(xì)胞，與病情發(fā)展密切相關(guān)5）。癌細(xì)胞釋放的外泌體含有大量與血管新生和免疫抑制相關(guān)的

分子，構(gòu)建適合癌細(xì)胞生長的微環(huán)境，促進(jìn)癌細(xì)胞的發(fā)展6）。另外，癌細(xì)胞來源的外泌體上的粘著分子表達(dá)形式?jīng)Q定著癌癥向器官的轉(zhuǎn)移途徑7）。最近，有報

告指出脂肪細(xì)胞釋放的外泌體對肝臟的遺傳基因表達(dá)有控制作用8）。許多病毒利用外泌體的產(chǎn)生路徑感染細(xì)胞，受病毒感染的細(xì)菌和寄生蟲通過外泌體控制其

他受細(xì)胞感染的細(xì)菌、寄生蟲的活動9、10）。

上述這些功能幾乎都是通過細(xì)胞分泌到外泌體中的分子引起的。其中，自從在外泌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)分泌細(xì)胞來源的mRNA和miRNA后，外泌體參與細(xì)胞間基因表達(dá)信

息的水平轉(zhuǎn)移的可能性備受矚目11）。這些RNA被外泌體的脂質(zhì)雙分子層膜所保護(hù)，不會被RNase所降解，可以在血液和體液中穩(wěn)定存在。被靶細(xì)胞吞噬的外

泌體通過與內(nèi)體膜融合，將RNA釋放到靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。釋放出來的mRNA除了被翻譯為蛋白質(zhì)，還通過miRNA抑制靶基因的翻譯，使得外泌體在靶細(xì)胞內(nèi)

調(diào)控基因表達(dá)。一個外泌體所含的蛋白質(zhì)有數(shù)萬種，mRNA、miRNA的種類有數(shù)千種以上，這些分子的組成因來源細(xì)胞的不同而異，也會根據(jù)細(xì)胞的狀態(tài)而變

化。另外，外泌體中這些物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與它們在分泌細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)不同，所以可能存在一種外泌體特異蛋白和mRNA/miRNA選擇性積累的機(jī)制。這種特異性可將

外泌體內(nèi)的RNA作為生物標(biāo)記，更進(jìn)一步作為治療開發(fā)的靶點(diǎn)。外泌體中的mRNA一旦被靶細(xì)胞吞噬，可能會引發(fā)該細(xì)胞內(nèi)的功能性蛋白的表達(dá)，但外泌體中

大部分的miRNA是前體而非功能性miRNA，這些miRNA具有何種生理性意義，學(xué)者們還在積極研究。由于外泌體含有各種蛋白質(zhì)、RNA和脂質(zhì)，研究人員正

將其按細(xì)胞進(jìn)行分類匯總，以建立數(shù)據(jù)庫?ExoCarta。此外，在世界各地分別運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)進(jìn)行大規(guī)模分析工作，而FunRich的

EVplugin已成為一種通用的分析手段。今后，在推進(jìn)外泌體研究方面，各個研究領(lǐng)域的信息共享至關(guān)重要。

運(yùn)用外泌體研發(fā)治療方法和診斷方法

近年來，隨著外泌體的功能逐漸闡明，越來越多的研究著眼于開發(fā)運(yùn)用外泌體功能的治療方法。例如，血液中的成纖維細(xì)胞（間充質(zhì)祖細(xì)胞的一種）所釋放的

外泌體，可以通過促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞的遷移、增殖和血管新生來促進(jìn)傷口愈合。報告指出，外泌體內(nèi)的促血管生成miRNA、抗炎性miRNA和促膠原蛋白沉淀miRNA

等參與了上述過程12）。從癌癥患者樹突狀細(xì)胞中釋放的外泌體含有各種癌癥細(xì)胞來源的蛋白質(zhì)，可以強(qiáng)化殺傷性T細(xì)胞對癌癥細(xì)胞的特異性反應(yīng)。利用此功能

的抗腫瘤免疫療法，目前正處于初期臨床研究階段13）。另一方面，也有研究嘗試?yán)猛饷隗w的功能抑制發(fā)病機(jī)制。例如，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的滑膜成纖維細(xì)

胞所釋放的外泌體，聚集了高濃度誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的TNF-α，可使類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎惡化14）。通過上述介紹可以知道癌癥細(xì)胞來源的外泌體含有與癌癥進(jìn)展相關(guān)的

分子，神經(jīng)細(xì)胞來源的外泌體含有與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的分子，因此通過抑制或去除這些外泌體，有望抑制疾病發(fā)生。隨著研究的不斷發(fā)展，還會擴(kuò)大外泌

體的功能闡明和臨床應(yīng)用的適應(yīng)性，有望將外泌體應(yīng)用于各種疾病的治療。此外，還可嘗試?yán)猛饷隗w將siRNA和抗癌藥劑等運(yùn)輸?shù)侥繕?biāo)細(xì)胞中。將各種細(xì)胞

粘著分子表達(dá)在外泌體膜表面上，由其形式?jīng)Q定外泌體被運(yùn)往哪一種細(xì)胞，該特性有望用于開發(fā)新型DDS15）。外泌體在體液中十分穩(wěn)定，同時外囊泡所含的

蛋白質(zhì)和RNA被外泌體的脂質(zhì)雙分子層膜所包被而免于降解。另外從收集后長期儲存的體液中所提取到的外泌體仍然比較完整，因此外泌體有望成為臨床檢測

的新型疾病生物標(biāo)記。外泌體與各種疾病的相關(guān)性已經(jīng)查明，特別是釋放到血液中的癌細(xì)胞來源的外泌體，與健康細(xì)胞來源外泌體和組成分子的差異性備受矚

目，并作為癌癥早期的診斷工具，被研究其與癌癥發(fā)展的相關(guān)性16）。此外，尿液中的外泌體有望作為腎臟、前列腺疾病和膀胱疾病的新型診斷標(biāo)記，腦脊液

中的外泌體作為腦部腫瘤和神經(jīng)退行性疾病的新型標(biāo)記。

外泌體研究的課題和展望

盡管目前已有許多關(guān)于外泌體作用的報導(dǎo)，但是在這些驗證實驗中使用了從體液和培養(yǎng)細(xì)胞上清中純化的高濃縮外泌體，所以可能無法反映它們在活體內(nèi)的真

實性狀。因此，目前尚未闡明該現(xiàn)象是否在活體內(nèi)真實發(fā)生了。確認(rèn)外泌體生理作用的唯一方法就是明確外泌體的釋放機(jī)制，通過促進(jìn)或抑制釋放機(jī)制，分析

會引起何種生理現(xiàn)象，這也是進(jìn)一步研究發(fā)展的方向。甚至生物體內(nèi)的外泌體動態(tài)（哪個外泌體遷移至何處）也會在今后的研究開發(fā)中成為重要的研究課題。

截止目前為止，外泌體純化的方法主要有超速離心法和PEG沉淀法，但利用這些方法提取的外泌體中混有非常多的雜質(zhì)，必須慎重分析所獲得的實驗結(jié)果是否

是由外泌體組成成分所引起的。并且超離法存在操作繁雜、回收率不穩(wěn)定、不能用于定量分析、必須使用昂貴的超速離心機(jī)、無法進(jìn)行多樣品分析檢測等問題

，因此外泌體的研究相對困難，需要盡快開發(fā)可簡單純化高純度外泌體的技術(shù)。因此FUJIFILM Wako著眼于巨噬細(xì)胞的外泌體受體Tim4，制備出Tim4細(xì)胞外

域與磁珠結(jié)合的“Tim4磁珠”17）。由于Tim4以鈣離子依賴性方式與外泌體膜表面的磷脂酰絲氨酸（PS）結(jié)合，因此用含有螯合劑乙二胺四乙酸（EDTA）的

洗脫緩沖液可將結(jié)合的外泌體釋放出來，從而獲得高純度的完整外泌體。實際上，用Tim4親和法純化的人白血病細(xì)胞釋放的外泌體，其純度與超離法和PEG沉

淀法純化的外泌體相比，可檢測出10~100倍以上的外泌體特異性蛋白，并且?guī)缀鯖]有外泌體以外的雜質(zhì)，由此證明通過該方法可以重復(fù)性良好地純化高純度外

泌體。因此，該方法可以檢測大量目前為止無法檢測的外泌體上的蛋白和RNA。利用Tim4對外泌體的強(qiáng)結(jié)合能力，可用ELISA或FACS高靈敏度檢測和定量外泌

體。此外，以往只能用差速離心法粗略純化的微囊泡，通過運(yùn)用Tim4親和法，可實現(xiàn)高純度純化微囊泡。本指導(dǎo)書中對這些技術(shù)進(jìn)行了詳細(xì)說明，我們期待這

項技術(shù)的有效性受到世界各方好評，并有望貢獻(xiàn)于外泌體和微囊泡的生理功能的分析研究。

外泌體的檢測和分離的難點(diǎn)，以及外泌體的分類方法多樣，導(dǎo)致研究人員尚未統(tǒng)一定義以何種方法純化的細(xì)胞外囊泡可以稱為“外泌體”，如何進(jìn)行實驗數(shù)據(jù)的

解釋和再現(xiàn)性的確認(rèn)是一項難題。近年隨著國際細(xì)胞外囊泡協(xié)會（ISEV）的設(shè)立、世界性研究者研討會的形成，國際標(biāo)準(zhǔn)的MISEV指南的提案，計劃進(jìn)行和開

始進(jìn)行EV研究的研究人員請務(wù)必閱讀這些方針18、19）。另外為了規(guī)避上述的混亂情況，還建立了記錄各論文實驗條件的EV-TRACK knowledge database20）。

一方面隨著EV研究倍受矚目，各國也啟動了大型研究項目。美國啟動NIH戰(zhàn)略性大型項目Extracellular RNA Communication，國際權(quán)威性會議?Gordon會

議和Keystone Symposia也于2016成立小組會。受歐洲藥物研究開發(fā)公司“創(chuàng)新藥物倡議組織（IMI）”的支持推進(jìn)的CANCER-ID項目也包含了EV研究。2017

年日本選定了EV研究為文部科學(xué)省研究開發(fā)戰(zhàn)略的目標(biāo)之一，期待會加速研究發(fā)展。無論如何，未來EV研究的發(fā)展，需開發(fā)可成為其研究基礎(chǔ)的穩(wěn)定的研究

方法和技術(shù)，期望Tim4親和法可成為其中之一。

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FUJIFILM Wako可提供外泌體生產(chǎn)、純化、檢測、分析一站式相關(guān)產(chǎn)品。

外泌體分離和純化試劑盒

MagCapture? 外泌體提取試劑盒PS Ver.2

MagCapture? 外泌體提取試劑盒PS Ver.2可以從細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清、血漿 等樣品中高純度且簡便快捷地純化外泌體等細(xì)胞外囊泡。通過應(yīng)用以鈣離子依賴

方式與細(xì)胞外囊泡表面的磷脂酰絲氨酸（PS）結(jié)合的Tim4，并使用螯合劑實現(xiàn)完整的細(xì)胞外囊泡純化。

純化細(xì)胞外囊泡專用RNA提取試劑盒

純化細(xì)胞外囊泡（EV）用microRNA Extractor? Kit

純化細(xì)胞外囊泡（EV）用microRNA Extractor? 試劑盒可以使用離心柱從外泌體等細(xì)胞外囊泡（Extracellular  Vesicle：EV）中提取包含microRNA在內(nèi)的總

RNA。只需少量洗脫液（20 μL）即可回收高濃度的RNA，因此 適用于二代高通量測序（Next Generation Sequencing，簡稱NGS）。

使用MagCapture? 外泌體分離試劑盒PS Ver.2分離外泌體后，提取RNA并進(jìn)行NGS分析。

外泌體高靈敏度定性分析

PS Capture? 外泌體流式試劑盒

PS Capture? 外泌體流式試劑盒是一款通過運(yùn)用與磷脂酰絲氨酸（PS）特異性結(jié)合的Tim4蛋白和磁珠的PS親和法，可將外泌體固定在磁珠上，并使用流式

細(xì)胞儀高靈敏度檢測標(biāo)記蛋白的試劑盒。

※ 使用前需自行準(zhǔn)備表面標(biāo)記蛋白對應(yīng)熒光染料標(biāo)記一抗、或一抗以及熒光染料標(biāo)記二抗。

外泌體檢測用ELISA試劑盒

※1：檢測用二抗會與人、小鼠、大鼠的IgG發(fā)生非特異性反應(yīng)，因此不可用于檢測血清、血漿。 

※2：試劑盒提供的抗體為抗人CD63抗體，因此對人以外的實驗對象進(jìn)行檢測時需要另外準(zhǔn)備合適的抗體。

※3：如使用的不是去除外泌體的FBS，則需要另外檢測FBS來源的PS陽性外泌體。

具有外泌體吸附抑制和冷凍保存作用的聚合物試劑

EV-Save? 細(xì)胞外囊泡保存穩(wěn)定劑

EV-Save? 細(xì)胞外囊泡保存穩(wěn)定劑是一款可抑制外泌體吸附于樣品管或槍頭等實驗器具的聚合物試劑。能防止實驗和保存過程中由于吸附引起的外泌體損耗，

提高回收率。可在樣品的超濾、純化和保存前添加本產(chǎn)品。

EV-Save? 細(xì)胞外囊泡保存穩(wěn)定劑（動物體內(nèi)實驗用）的組成成分僅使用具有醫(yī)藥添加劑使用實例的成分，是一款可用于外泌體給藥實驗動物的外泌體吸附

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